如何冻存贴壁细胞？

1)将需要那冻存的细胞从CO2培养箱中取出，在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，吸弃瓶内的培养基；

2)向培养内加入无菌1×PBS 3ml，之后水平放置培养瓶，旋转震荡培养瓶，使PBS能够浸润到培养平面上所都的面积，吸弃PBS；

3)重复步骤2一次，之后向瓶内加入消化液2ml，轻微震荡后放入37℃ CO2培养箱中孵育1min左右（个别难消化的细胞按传代中的消化步骤）；

4)孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，如还有部分细胞未消化下来，可在生物安全柜内用移液管吸起消化液，吹打培养平面；

5)向消化下细胞的培养瓶中加入3ml含10%血清的完全培养基终止消化，然后将培养瓶中的液体转入15ml离心管中，300g离心5min；

6)离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8ml冻存管中；

7)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

8)第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。