贴壁细胞如何传代?1)当细胞汇合度达到80%-90%时,可进行传代。 2)在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基; 3)向培养瓶内加入3ml无菌的1×PBS 后,水平放置培养瓶,使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃PBS,对于分泌物比较多的细胞可以重复2-3次。也可以轻轻的冲洗; 4)向瓶内加入消化液1ml,浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育1~2min(具体以细胞贴壁是否牢固决定时间,当胰酶加入后培养箱内30秒以后细胞开始逐步脱落的过程中可以 移出培养箱至显微镜下观察后续细胞变圆脱落情况,当90%细胞都脱落后立马终止消化,剩下的10%左右的细胞可以单独处理完换液继续培养有可能也可以生长起来); 5)孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若绝大多数消化下来则直接向培养瓶内加入3ml含10%FBS的完全培养基中,将悬液吸入15ml离心管;一定要彻底终止消化, 以防含有EDTA的胰酶残留,会损伤刺激细胞膜。在以消化下来为前提的情况下,减少胰酶对细胞膜的损伤时间,有助于维持细胞系的状态持续稳定,降低老化速度) 6)800-1000rpm离心4-5min; 7)准备两个新的T-25培养瓶,各加入4ml完全培养基。 8)离心完成后,弃上清,用2ml完全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入2个T-25培养瓶,每个培养瓶各1ml; 9)水平放置培养瓶,震荡混匀后,将培养瓶置于37℃,5%CO2培养箱中静置培养。 注意: a)个别比较难消化的细胞,每次消化不超过2min,如果消化2min后,培养瓶中还有较多细胞贴壁,可采用分步消化,将消化下来的细胞移入15mL离心管中和,再向培养瓶中加入 胰酶继续消化,每次消化不超过2min,直到完全消化下来为止。 b)细胞传代建议1传2,前期传代后冻存一份细胞,另外一份细胞继续扩增,确保细胞种子保留好之后可以扩大传代比例。 c)特殊细胞贴壁特别牢固的也可以采用长时间消化法或者物理细胞铲(刮)把细胞消化或者刮下来,比如巨噬类细胞。 d)有一些细胞属于半贴壁生长,收货后一部分贴壁,还有一部分悬浮的情况下,注意不要把悬浮的细胞全部抽掉不要,或许还是活细胞,应该根据密度数量情况决定是否需要收集 起来和贴壁一重新铺瓶。 声明:此篇为如耀生物原创文章,转载请标明出处链接:http://ruyaobio.com/nd.jsp?id=26
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